isolasi DNA

I.         PENDAHULUAN

1.1  Latar Belakang

Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu DNA dan RNA. DNA yang terdapat di inti sel adalah  DNA kromosomal, DNA yang terdapat di luar inti sel  atau sitoplasmik  adalah DNA ekstrakromosomal, yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA plasmid. Proses denaturasi dan renaturasi molekul DNA tergantung pada banyaknya  factor, beberapa diantaranya adalah suhu, pH, konsentrasi iso elektrolit dan rasio (GC:AT). Suhu, T-melting (Tm) yang tinggi menyebabkan untai ganda (double helix) DNA akan terurai menjadi untai tunggal (single helix). Apabila suhu ini diturunkan secara perlahan maka akan terjadi renaturasi menjadi untai ganda DNA kembali seperti semula. pH (derajat keasaman) yang ekstrim pun (pH < 3, atau pH > 10) dapat menyebabkan DNA terdenaturasi. Konsentrasi iso elektrolit seperti Na⁺ dan K, serta makin tinggi rasio kandungan  basa nukleotida (GC:AT) maka akan memperlambat proses denaturasi DNA. Sedangkan Reaksi polymerase berantai (Polimerase Chain Raeksi = PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode PCR dapat  meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula (10⁶-10⁷). Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi  dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah bagaimana cara amplifikasi hanya pada DNA target dan meminimalisiramplifikasi urutan DNA yang bukan target. Proses PCR merupakan proses siklus berulang meliputi denaturasi–annealing–ekstensi oleh enzim DNA polymerase. Taq DNA polymerase diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) yang dikembangkan tahun 1988. Enzim mini tahan sampai suhu mendidih 100°C, dan aktivitas maksimal pada suhu 70-72°C. Sepasang primer oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hybrid dengan  ujung 5‟ menuju ujung 3‟ untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang dikehendaki.

1.2  Tujuan

·         Untuk mengetahui pengertian isolasi DNA dan PCR

·         Untuk mengetahui uji kualitas DNA

·         Untuk mengetahui komponen dan tahapan PCR

·         Untuk mengetahui manfaat PCR

II.                TINJAUAN PUSTAKA

2.1  Pengertian Isolasi DNA dan PCR

·         Penggunaan DNA untuk analisis atau manipulasi biasanya perlu diisolasi dan dimurnikan sampai batas tertentu. DNA pulih dari sel dengan metode yang mungkin paling lembut pecahnya sel untuk mencegah DNA dari fragmentasi oleh geseran mekanik.

(Walker, 2009)

·         Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah.

(Asris, 2010)

·         PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.

(Mahmudin, 2010)

·         Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro.

(Fatchiyah, 2012)

2.2  Uji Kualitas DNA

Analisa kualitas merupakan serangkaian proses yang berperan untuk mengetahui konsentrasi dan menganalisa kualitas dari DNA tersebut. Kualitas DNA sangat erat kaitannya dengan kemurnian DNA terhadap berbagai kontaminan seperti kontaminan protein. Kemurnian DNA dapat diukur melalui rasio antara absorpsi suspensi DNA pada panjang gelombang 256 nm terhadap panjang gelombang 280 nm.

(Anonymous^a, 2008)

2.3  Komponen Dan Tahapan PCR

Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, ensim DNA polimerase yang thermostabil,  buffer PCR, ion Mg²⁺,  dan thermal cycler.

·         Template DNA

Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp) atau 1KB, Hasil amplifikasi yang efisien antara 100-400bp. Walaupun kemungkinan hasil amplifikasi lebih dari 1 kB tetapi prosesnya kurang efisien, karena produk yang panjang rentan terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja ensim DNA polymerase dan waktu yang diperlukan lebih lama. Hal ini  dapat menyebabkan hasil amplifikasi yang tidak diinginkan.

·         Primers

Primer disusun dari sintesis oligonukleotida sepanjang 15-32bp dan primer ini harus mampu mengenali urutan yang akan diamplifikasi. Untuk standar amplifikasi sepasang primer akan mempunyai kisaran pasangan basa sekitar 20 basa panjangnya pada tiap primernya. Kandungan GC harus antara 45-60%. Annealing temperatur antara primer yang digunakan harus berkisar antara 1°C. Ujung 3’ dari setiap primer harus G atau C, akan tetapi hindari susunan nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini, misal CCG, GCG, GGC, GGG, CCC, GCC. Pada penentuan atau penyusunan sepasang primer, penting diperhatikan urutan primer tidak saling komplementer sehingga membentuk dimer-primers, berikatan satu sama lain, atau membentuk hairpins. Hal lainnya hindari menyusun primer pada daerah DNA repetitif.

·         Taq DNA polymerase

Enzim ini bersifat thermostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas polimerisasi DNAnya dari ujung-5’ ke ujung-3’ dan aktivitas enzimatik ini mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit pada 95ºC. Biasanya untuk setiap 100μl volume reaksi ditambahkan 2,0-2,5 unit.

·         PCR buffer dan konsentrasi Mg²⁺

Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8.3) dan 1.5 mM MgCl₂. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain.  Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl₂.

Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg²⁺ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg²⁺ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg²⁺yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.

·         Nucleotides (dNTPs)

Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 μM. Pada konsentrasi ini penting untuk mengatur konsentrasi ke-empat dNTP pada titik estimasi Km untuk setiap dNTP. 50mM, harus selalu diatur pH7.0. Konsentrasi yang tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim polymerase. Sedang pada konsentrasi rendah akan memberikan ketepatan dan spesifitas yang tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan merubah secara bebas.

·         PCR Thermal Cycler

PCR thermal cycler pertama kali dikembangkan oleh perusahaan PerkinElmer sebagai pemegang paten asli. Pada saat ini telah diproduksi berbagai macam tipe alat PCR thermal cycler ini dari berbagai perusahaan yang bergerak dalam bioteknologi. Walaupun nama masing-masing alat itu berbeda tetapi prinsip kerjanya sama.

(Fachtiyah, 2012)

2.4  Manfaat PCR

·         Untuk mengetahui keragaman genetik

Hal ini penting diketahui untuk proses persilangan, sehingga di dapat varietas unggul, jika keragaman tinggi maka kekerabatannya akan semakin tinggi, begitu pula sebaliknya.

·         Seleksi

Untuk memilih tanaman yang sifatnya sesuai dengan yang diinginkan. MAS (Marker Assisted Selection): penanda pembantu seleksi. Keuntungan seleksi dengan PCR yaitu mampu menyeleksi dalam waktu cepat, tidak perlu menunggu hingga tanaman dewasa.

·         Uji kemurnian benih

Uji perlindungan varietas tanaman agar hak paten benih tidak dibajak oleh orang lain.

(Puspita, 2010)

III.             METODOLOGI

3.1  Alat, bahan, dan fungsi

3.1.1   Alat

·         Mortar & pestle     : untuk menghaluskan bahan

·         gelas ukur             : untuk mengukur larutan yang akan digunakan

·         Tabung eppendorf            : sebagai tempat untuk bahan yg diuji

·         tissue                    : untuk membersihkan

·         gunting                  : untuk menggunting bahan yang akan digunakan

·         mikropipet                        : untuk mengambil larutan dalam jumlah yang kecil

·         spatula                  : sebagai alat untuk mencampur bahan

·         erlenmeyer                        : tabung untuk wadah bahan yang diuji

·         microwave                        : sebagai alat untuk pensterilan

·         mesin vortex         : sebagai alat untuk menghomogenkan bahan

·         timbangan analitik : sebagai alat untuk menimbang bahan

·         stirer                     : sebagai alat untuk mencampurkan bahan

·         pH meter               : untuk mengukur pH

·         mesin centrifuge   : untuk mengetahui perbedaan lapisan antara supernatan dan lapisan lainnya

·         autoclave              : untuk pensterilan bahan

·         freezer                  : untuk penginkubasian larutan

3.1.2   Bahan

·         Buffer ekstraksi CTAB dan Merkaptoethanol : untuk melisis membran sel daun

·         nitrogen cair          : untuk mempermudah penggerusan

·         PVP (polyvinilpirolidone)             : untuk melindungi agar DNA tidak rusak

·         CHISAM (Chloroform, Isoamilalkohol) : untuk mendegradasi protein

·         buffer pencuci      : sebagai larutan penyangga

·         buffer TE

·         RNAse                  : sebagai enzim dalam isolasi DNA

·         Isopropanol          : untuk resipitasi

·         Daun srikaya        : sebagai bahan yang diuji

3.2  Cara Kerja

+ buffer ekstrasi                           timbang sample 0,3 

CTAB (1 ml)                                 gr + PVP 1 % + N₂ -196 ºC

 

+ β mercaptoetanol 5 μl

+ inkubasi 30’ 65 ºC

+ chisam 500 μl

Di vortex

sentrifuge 10000 rpm 10’

 

Ambil supernatan

 

+ chisam 1 x volume supernatan

 

Sentrifuge 10000 rpm 10’

 

+ isopropanol 0,45 x volume supernatan

    invert

Inkubasi freezer 30’

 

Sentrifuge 10000 rpm 10’

                                                       Buang isopropanol

DNA pellet

+ buffer pencuci 200 μl 2x

 

+ RNAse 1 μl

+ resuspensi dengan elution buffer 20-50 μl

 

Simpan untuk elektroforesis

3.3  Analisa Perlakuan

Pada praktikum isolasi DNA ini bahan yang digunakan adalah daun srikaya. Langkah pertama yang dilakukan adalah mengisi tabung eppendorf dengan 1 ml buffer ekstraksi CTAB (CTAB 3%, NaCl 1,4 M, EDTA 0,002M dan Tris -HCl 0,1M) dan 5 µl  mercaptoethanol. Daun srikaya ditimbang 0,3 gram dan digerus  dalam mortar dengan bantuan nitrogen cair dan ditambah PVP 1%, kemudian dimasukkan kedalam tabung eppendorf yang sudah berisi 1 ml buffer ekstraksi CTAB  dan 5 µl mercaptoethanol. Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen. Ekstrak daun diinkubasi dalam  suhu 65 ^oC selama 30 menit sambil dibolak-balik tiap 10 menit. Kemudian ditambahkan 500 µl chisam (Chloroform : Isoamylalcohol (24:1)). Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen. Ekstrak daun kemudian disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm.  Dan diambil supernatannya. Supernatan dimasukkan pada mikrovivet baru dan ditambahkan chisam 1 x volume supernatan. Larutan supernatan dan chisam disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm. Fase atas dimasukkan tabung baru ditambah isopropanol 0,45 x volume supernatan. Larutan tersebut dibolak-balik perlahan hingga tampak benang-benang putih dalam larutan. Larutan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit. Setelah diinkubasi, larutan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10000 rpm setelah itu supernatan dibuang dengan hati-hati agar endapan DNA pellet tidak ikut terbuang. Endapan DNA pellet dicuci dengan buffer pencuci dengan cara menambahkan 200 μl buffer pencuci ke dalam tube,  kemudian cairan di buang. Pencucian ini dilakukan 2 kali. Setelah itu endapan DNA pellet dikering anginkan. Endapan DNA kemudian diresuspensi dengan 20-50 μl buffer TE lalu ditambah 1 μl RNAse dan disimpan dalam lemari es untuk elektroforesis.